Rôles respectifs des mutations PIK3CA et de l’imprégnation à l’acétate de cyprotérone dans la tumorigenèse des méningiomes de souris
Pierre-Cyril Cômes, Tuan Le Van, Suzanne Tran, Solène Huard, Samiya Abi-Jaoude, Quitterie Venot, Pauline Marijon, Julien Boetto, Antoine Blouin, Franck Bielle, Yohan Ducos, Yu Teranishi, Michel Kalamarides, et Matthieu Peyre
Malgré leur rareté, les mutations PIK3CA dans les méningiomes ont suscité l’intérêt en tant que mutations ubiquitaires potentiellement ciblables en raison de leur présence dans les tumeurs sporadiques bénignes et malignes, mais aussi dans les cas liés aux hormones.
En utilisant de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées, nous démontrons ici que les mutations Pik3ca dans les cellules méningées postnatales sont suffisantes pour favoriser la formation de méningiomes mais aussi la progression de la tumeur chez la souris. Inversement, l’imprégnation hormonale, seule ou en association avec les mutations Pik3ca et Nf2, n’induit pas la tumorigenèse des méningiomes mais favorise la formation de tumeurs mammaires. Nous confirmons ensuite in vitro l’effet des mutations de Pik3ca mais pas de l’imprégnation hormonale sur la prolifération de cultures primaires de cellules méningées de souris. Enfin, nous montrons par analyse exomique des tumeurs du sein et des méninges que l’imprégnation hormonale favorise la formation de tumeurs du sein sans mutation oncogénique somatique supplémentaire mais qu’elle est associée à une charge mutationnelle accrue sur fond de mutation de Pik3ca. L’ensemble de ces résultats tend à suggérer un rôle prépondérant des mutations de Pik3ca sur l’imprégnation hormonale dans la tumorigenèse des méningiomes, l’effet exact de cette dernière restant à découvrir.
Thérapie génique du cancer ; https://doi.org/10.1038/s41417-023-00621-2
INTRODUCTION
Les méningiomes sont les tumeurs primaires les plus fréquentes du système nerveux central chez les adultes et sont pour la plupart bénins (grade I de l’OMS). Ces dernières années, des efforts considérables ont été déployés pour élucider la biologie moléculaire des méningiomes aux niveaux génétique, transcriptomique et épigénétique. Si ces études ont permis de mieux comprendre la tumorigenèse des méningiomes, aucun traitement supplémentaire n’a encore vu le jour à la suite de ces découvertes. Les mutations du gène NF2 restent l’événement moteur le plus fréquent dans les méningiomes, et les divers rôles biologiques de la merlin, le produit du gène NF2, rendent difficile la mise au point d’un traitement efficace. Nous avons donc décidé de concentrer nos efforts sur un facteur moins fréquent mais plus facile à cibler dans la tumorigenèse des méningiomes, le gène PIK3CA, dont le rôle dans la maladie s’est récemment accru.
Dans les méningiomes de grade I de l’OMS, les mutations de PIK3CA sont présentes dans 4,7 % de toutes les tumeurs et dans 7,4 % des cas de méningiomes non NF2. Dans la majorité des cas (68 %), les mutations de PIK3CA coïncident avec des mutations de TRAF7, ce qui fait douter que les mutations de PIK3CA suffisent à elles seules à favoriser la tumorigenèse des méningiomes. Plus récemment, les mutations PIK3CA dans les méningiomes ont suscité l’intérêt en raison de leur rôle prépondérant dans la tumorigenèse des méningiomes associés aux hormones. Les méningiomes sont considérés comme des tumeurs hormono-sensibles en raison de leur association avec le sexe féminin (sex-ratio, F/M 2:1), de la présence de récepteurs à la progestérone à leur surface et de l’évolution rapide de la taille des méningiomes observée au cours de la grossesse. Après plusieurs rapports de cas et séries sur l’association entre la prise de progestatifs anti-androgènes synthétiques (acétate de cyprotérone, acétate de chlormadinone, acétate de nomégestrol) et les méningiomes, une étude épidémiologique récente a confirmé l’augmentation du risque de développer des méningiomes après un traitement progestatif anti-androgène prolongé. Nous avons également caractérisé cette association en démontrant un changement dans le paysage mutationnel des méningiomes associés aux progestatifs par rapport à une série de tumeurs non sélectionnées. Les méningiomes associés aux progestatifs étaient principalement des tumeurs de la base du crâne mutantes PIK3CA. Les mécanismes de tumorigenèse qui sous-tendent l’association entre la prise de progestatifs et les mutations de PIK3CA sont encore inconnus.
Afin de déterminer si les mutations de PIK3CA suffisent à promouvoir la tumorigenèse des méningiomes bénins et agressifs et de déterminer le rôle associé de l’apport hormonal, nous avons créé un nouveau modèle murin de méningiome mutant Pik3ca. Nous montrons tout d’abord que les profils d’expression des récepteurs de la progestérone chez la souris sont comparables à ceux des méninges humaines. Nous démontrons ensuite que, chez la souris, les mutations Pik3ca dans les cellules méningées postnatales sont suffisantes pour favoriser la formation de méningiomes, contrairement à l’imprégnation d’acétate de cyprotérone, qui n’est pas suffisante pour favoriser la formation de méningiomes chez la souris, qu’elle soit seule ou associée à des mutations Pik3ca et Nf2. Nous confirmons ces résultats par une analyse in vitro de l’effet de l’acétate de cyprotérone et des mutations Pik3ca sur des cultures primaires de cellules durales et arachnoïdiennes de souris. Enfin, nous montrons que l’imprégnation progestative favorise la formation de tumeurs sans mutation somatique supplémentaire, mais qu’elle est associée à une charge mutationnelle accrue lorsqu’elle est combinée à des mutations Pik3ca.
RÉSULTATS
Expression des récepteurs de la progestérone dans les méninges de souris
Afin de déterminer si la souris est un modèle fiable pour tester l’effet de l’imprégnation hormonale par rapport à l’homme, nous avons décidé d’étudier l’expression des récepteurs de la progestérone dans les méninges de souris. Le principal récepteur de la progestérone, Pgr, est une protéine cytoplasmique qui se dimérise et se transloque dans le noyau pour activer les éléments de réponse à la progestérone (PRE) dans l’ADN lors de la liaison de la progestérone. La coloration nucléaire de la Pgr est donc considérée comme un marqueur fiable de l’activation de la Pgr, et la Pgr est exprimée dans la majorité des méningiomes. Dans les méninges normales, l’expression de la Pgr a été observée dans le tissu arachnoïdien normal de l’homme et du lapin. Outre Pgr, d’autres récepteurs transmembranaires ont été plus récemment associés aux effets dépendant de la progestérone, tels que Pgrmc1 (Progesterone receptor membrane component 1). Suite à sa description dans les méninges de rat, nous avons décidé d’étudier son expression dans les méninges de souris.
Nous avons d’abord analysé l’expression des récepteurs nucléaires de la progestérone chez les souris adultes en nous basant sur les données d’hybridation d’Allen Atlas (Fig. 1, panneau supérieur, voir lien). Contrairement à Pgds, un marqueur robuste des méninges, Pgr et Pgrmc1 n’étaient pas exprimés dans les méninges de souris, sauf en des endroits dispersés. Comme les images de l’Atlas Allen n’englobent pas les leptoméninges, nous avons effectué une analyse immunohistochimique supplémentaire des récepteurs de la progestérone Pgr et Pgrmc1 dans les méninges de souris. Nous montrons que Pgrmc1 est exprimé dans les cellules arachnoïdiennes à partir de E18 à la fois à la base du crâne et à la convexité. En revanche, nous n’avons pas pu mettre en évidence de coloration nucléaire de Pgr dans l’arachnoïde et la dure-mère de souris en développement et adultes (Fig. 1, panneau inférieur). Les données de séquençage des ARN en vrac provenant de la dure-mère néonatale confirment l’expression de Pgrmc1 et Pgrmc2 dans les méninges de souris, mais pas de Pgr [19], comme dans les analyses unicellulaires de la dure-mère humaine normale [20]. En raison de la similitude des profils d’expression des récepteurs de la progestérone chez la souris et l’homme, au moins au niveau transcriptomique, nous avons considéré que la souris pouvait être un modèle fiable d’imprégnation hormonale.
La mutation Pik3ca dans les cellules méningées postnatales est suffisante pour favoriser la formation de méningiomes chez la souris
Pour étudier le rôle de la mutation de Pik3ca dans la tumorigenèse méningée, nous avions précédemment généré une cohorte de souris PGDSCre;Pik3ca et observé que l’activation prénatale de Pik3ca dans les cellules PGDS-positives n’était pas suffisante pour favoriser la tumorigenèse des méningiomes chez la souris. Nous avons donc cherché à analyser l’effet de l’activation postnatale de Pik3ca et avons généré une première cohorte de 20 souris Pik3caflox/flox auxquelles nous avons injecté de l’adCre (volume moyen : 3 μL) entre le jour 2 et le jour 5 postnatal (tableau 1 et figure 2, voir lien). En raison de la diffusion intravasculaire et sous-cutanée de l’adCre, nous avons observé 95 % d’hypertrophie précoce de la tête associée à des malformations vasculaires sous-cutanées, conduisant à une mortalité précoce (survie moyenne : 1,6 mois) (Fig. 1 supplémentaire). Lors de l’analyse histologique, nous avons néanmoins observé 30% de méningiomes, dont une souris avec deux méningiomes distincts de sous-types histologiques différents (Fig. 3A) et une tumeur de grade II avec invasion cérébrale et plusieurs mitoses chez une souris âgée de 9 mois (Fig. 3C, D). Il est intéressant de noter que nous avons également observé un cas de cavernome intraparenchymateux (Fig. 3B).
Nous avons également décidé d’analyser l’effet de l’activation de Pik3ca dans les méninges de souris adultes. Une cohorte de 22 souris Pik3caflox/flox a donc été injectée avec de l’adCre (volume moyen : 6 μL) à 6 semaines, soit au niveau de la convexité (15 souris), soit au niveau de la base du crâne (7 souris). Nous avons observé 50 % de méningiomes, dont une souris hébergeant un méningiome fibroblastique de la convexité et un méningiome transitionnel de la base du crâne (Fig. 3E, F). Alors que les méningiomes étaient principalement méningothéliaux dans le modèle postnatal (5/6, 83%), ils étaient principalement fibroblastiques dans le modèle adulte (7/11, 63%).
Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que l’expression postnatale d’une forme mutante de Pik3ca dans les méninges est suffisante pour favoriser la formation de méningiomes de différents grades et sous-types histologiques, contrairement à l’expression prénatale.
La prise d’acétate de cyprotérone ne favorise pas la formation de méningiomes chez la souris, que ce soit seul ou en combinaison avec des mutations de Pik3ca ou de Nf2.
Afin d’étudier le rôle de la prise de progestatifs sur la tumorigenèse des méningiomes, nous avons traité une cohorte de 29 souris de type sauvage avec de l’acétate de cyprotérone (ACP) pendant 9 mois. Après un suivi moyen de 11 mois, nous n’avons trouvé aucun méningiome à l’analyse histologique mais avons observé une hypertrophie de l’utérus (Fig. 4A) chez toutes les souris, démontrant ainsi l’imprégnation par l’ACP, comme décrit précédemment dans les modèles murins de cancer du sein. De manière intéressante, nous avons également découvert des tumeurs mammaires chez 90% des souris, définies comme des carcinomes muco-épidermoïdes du sein (Fig. 4B, C) et un kyste épidermoïde intramédullaire rachidien (Fig. 4D). Afin de déterminer si la prise de progestatifs et l’activation de Pik3ca pouvaient se synergiser pour favoriser la formation de méningiomes chez la souris, nous avons traité une cohorte de 22 souris PGDSCre ; Pik3caH1047R avec de l’ACP pendant 8 mois. Comme pour le premier groupe imprégné d’ACP, les souris ont été sacrifiées après un suivi moyen de 8,3 mois en raison de tumeurs mammaires. Le diagnostic histologique n’a révélé aucun méningiome. La fréquence des méningiomes étant faible chez les souris PGDSCre ; Pik3caH1047R, nous avons cherché à déterminer si la prise de l’ACP pouvait entrer en synergie avec l’activation postnatale des mutations Pik3ca. Afin d’éviter les effets de la diffusion intravasculaire et sous-cutanée de l’adCre, nous avons abaissé le volume injecté à 1 μL et généré deux cohortes de souris adCre ; Pik3caH1047R avec (13 souris) et sans (14 souris) imprégnation de l’ACP. Le taux de malformations vasculaires sous-cutanées a été abaissé à 62% dans le groupe témoin et à 23% dans le groupe traité par ACP. La survie des souris a néanmoins été réduite (Fig. 2B), et 10 souris sur 13 n’ont reçu que 3 mois d’imprégnation à l’ACP, contre 9 mois dans les cohortes précédentes. Alors que la fréquence des méningiomes dans le groupe témoin était similaire à celle de notre cohorte précédente (29 % contre 30 %), elle était beaucoup plus faible (8 %) dans le groupe traité à l’ACP.
Enfin, nous avons postulé que la prise de progestatifs pouvait contribuer à la croissance de tumeurs bénignes préexistantes. Nous avons donc décidé de traiter une cohorte de 17 souris PGDSCrehet ; Nf2del2/flox avec de l’acétate de cyprotérone par rapport à une cohorte témoin de 19 souris PGDSCrehet ; Nf2del2/flox. L’analyse histologique après un suivi moyen de 9,5 mois a révélé 88 % de méningiomes fibroblastiques de la base du crâne dans le groupe traité par ACP et 89 % de méningiomes fibroblastiques de la base du crâne dans le groupe témoin. La taille moyenne de la tumeur était de 0,2294 mm2 (médiane : 0,118 mm2 ; intervalle : 0,033-0,718) dans le groupe traité par ACP et de 0,305 dans le groupe témoin (médiane : 0,256 mm2 ; intervalle : 0,067-0,823). Nous n’avons pas trouvé de différence statistiquement significative dans la taille des tumeurs entre les deux groupes. Collectivement, ces résultats indiquent que l’acétate de cyprotérone n’a pas favorisé la formation et/ou la progression des méningiomes chez les souris, que ce soit sur un fond génétique lié à Pik3ca ou à Nf2.
Les mutations de Pik3ca, mais pas l’acétate de cyprotérone, augmentent la prolifération des cellules méningées in vitro
Pour analyser l’effet de l’activation de Pik3ca dans les méninges en fonction de leur nature, nous avons établi des cultures primaires d’arachnoïde et de dure-mère à partir des méninges de la base du crâne de souris Pik3caH1047R. L’infection par AdCre des cellules primaires in vitro a été évaluée par la détection de la fluorescence de la GFP (Fig. 5C). Aucune fluorescence n’a été exprimée dans les cellules témoins infectées par adLacZ (données non présentées). Les tests de prolifération ont montré que l’expression de Pik3caH1047R induisait un avantage prolifératif à la fois dans les cellules arachnoïdiennes et durales au jour 9 (p < 0,05, test t) (Fig. 5A, B). La prolifération accrue a été associée à l’activation de la voie Pi3k-Akt-mTor par une phosphorylation accrue d’Akt et de S6RP (Fig. 5D) démontrée à la fois dans l’arachnoïde et la dure-mère (Tableau supplémentaire 1). L’acétate de cyprotérone n’a pas permis d’augmenter la prolifération cellulaire des cellules durales, que ce soit seul ou en combinaison avec l’expression de Pik3caH1047R (Fig. 5E, G). Dans les cellules arachnoïdiennes, cependant, l’acétate de cyprotérone a augmenté la prolifération cellulaire, seul et en combinaison avec l’ACP, sans atteindre une signification statistique (Fig. 5F, H).
Analyse de l’exome de tumeurs et de méninges liées à l’hormone et à Pik3ca chez la souris
Afin de déterminer si l’imprégnation de progestatif suffit à promouvoir la mutagenèse dans les tissus de souris, nous avons décidé d’effectuer une analyse de l’exome sur des méninges de souris traitées à l’ACP par rapport à des méninges de contrôle et dans des tumeurs mammaires liées à l’ACP, soit sur un fond de type sauvage, soit sur un fond de mutant Pik3ca. Cinq tumeurs et deux méninges ont été analysées. Nous n’avons pas trouvé de mutation oncogène dans les méninges de souris. Dans la tumeur mammaire développée sur un fond de type sauvage, aucune mutation oncogénique n’a été observée. Il est intéressant de noter que dans les tumeurs mammaires développées en combinaison avec des mutations de Pik3ca, nous avons trouvé des mutations supplémentaires déjà décrites dans les tumeurs mammaires humaines, y compris des mutations de Map2k4 et de Ctnnb1 décrites dans la base de données COSMIC (Fig. 6 et Tableau supplémentaire 2, voir lien).
