Respective roles of PIK3CA mutations and the impregnation to cyproterone acetate in the tumorigenesis of mouse meningiomas
Pierre-Cyril Cômes, Tuan Le Van, Suzanne Tran, Solène Huard, Samiya Abi-Jaoude, Quitterie Venot, Pauline Marijon, Julien Boetto, Antoine Blouin, Franck Bielle, Yohan Ducos, Yu Teranishi, Michel Kalamarides, and Matthieu Peyre
Despite their rarity, PIK3CA mutations in meningiomas have aroused interest as potentially target ubiquitous changes due to their presence in benign and malignant sporadic tumors, but also in cases related to hormones.
Using new genetically modified models of mice, we show here that PIK3CA mutations in postnatal mening cells are sufficient to promote the formation of meningiomas but also the progression of the tumor in mice. Conversely, hormonal impregnation, alone or in combination with PIK3CA and NF2 mutations, does not induce the tumorigesis of meningiomas but promotes the formation of breast tumors. We then confirm in vitro the effect of PIK3CA mutations but not of the hormonal impregnation on the proliferation of primary cultures of mouse -mounted cells. Finally, we show by exomic analysis of the tumors of the breast and the meninges that the hormonal impregnation promotes the formation of breast tumors without additional somatic oncogenic mutation but that it is associated with an increased mutational load against the background of PIK3CA mutation. All of these results tend to suggest a preponderant role in PIK3CA mutations on hormonal impregnation in the tumorigesis of meningiomas, the exact effect of the latter remaining to be discovered.
Thérapie génique du cancer ; https://doi.org/10.1038/s41417-023-00621-2
INTRODUCTION
Meningiomas are the most frequent primary tumors of the central nervous system in adults and are mostly mild (Grade I of the WHO). In recent years, considerable efforts have been made to elucidate the molecular biology of meningiomas at genetic, transcriptomic and epigenetic levels. If these studies have made it possible to better understand the tumorigesis of meningiomas, no additional treatment has yet emerged following these discoveries. Mutations of the NF2 gene remain the most common engine event in meningiomas, and the various biological roles of the Merlin, the product of the NF2 gene, make it difficult to develop effective treatment. We therefore decided to focus our efforts on a less frequent factor but easier to target in the tumorigesis of meningiomas, the Pik3CA gene, whose role in the disease has recently increased.
In WHO grade I meningiomas, PIK3CA mutations are present in 4.7 % of all tumors and in 7.4 % of non -NF2 meningiomas. In the majority of cases (68 %), PIK3CA mutations coincide with Traf7 mutations, which makes doubt that PIK3CA mutations alone are enough to promote the tumorigerisis of meningiomas. More recently, PIK3CA mutations in meningiomas have aroused interest due to their preponderant role in the tumorigenesis of meningiomas associated with hormones. Meningiomas are considered hormone-sensitive tumors because of their association with the female sex (sex-ratio, f/m 2: 1), the presence of progesterone receptors on their surface and the rapid evolution of the size of meningiomas observed during pregnancy. After several cases reports and series on the association between the taking of synthetic anti-Androgenic progestins (cyproterone acetate, chlormadinone acetate, nomigestrol acetate) and meningiomas, a recent epidemiological study confirmed the increase in the risk of developing meningiomas after prolonged anti-angogenic treatment. We have also characterized this association by demonstrating a change in the mutational landscape of meningiomas associated with progestins compared to a series of unrepected tumors. The meningiomas associated with the progestins were mainly tumors of the PIK3CA mutant skull base. The tumorigernesis mechanisms underlying the association between taking progestins and PIK3CA mutations are still unknown.
In order to determine whether PIK3CA mutations are enough to promote the tumorigesis of mild and aggressive meningomes and to determine the associated role of hormonal contribution, we have created a new MURIN MURIN MUNING MUTING PIK3CA. We show first of all that the expression profiles of progesterone receptors in mice are comparable to those of human meninges. We then demonstrate that, in mice, PIK3CA mutations in postnatal mening cells are sufficient to promote the formation of meningiomas, unlike the impregnation of cyproterone acetate, which is not sufficient to promote the formation of meningiomas in mice, whether it is alone or associated with PIK3CA and NF2 mutations. We confirm these results by an in vitro analysis of the effect of cyproterone acetate and PIK3CA mutations on primary cultures of dural and arachnoid cells of mice. Finally, we show that the progestogen impregnation promotes the formation of tumors without additional somatic mutation, but that it is associated with an increased mutational load when it is combined with PIK3CA mutations.
RESULTS
Expression of progesterone receptors in mouse meninges
In order to determine if the mouse is a reliable model to test the effect of hormonal impregnation compared to man, we have decided to study the expression of progesterone receptors in mouse meninges. The main progesterone receptor, PGR, is a cytoplasmic protein that diminishes and translocuous into the nucleus to activate the response elements (PRE) in DNA during the connection of progesterone. The nuclear coloring of the PGR is therefore considered a reliable marker of the activation of the PGR, and the PGR is expressed in the majority of meningiomas. In normal meninges, the expression of the PGR was observed in the normal arachnoid fabric of man and rabbit. In addition to PGR, other transmembrane receptors have been more recently associated with the effects depending on progesterone, such as PGRMC1 (Progesterone Receptor Membrane Component 1). Following his description in the brain's meninges, we decided to study his expression in mouse brain.
We first analyzed the expression of progesterone nuclear receptors in adult mice based on the hybridization data of Allen Atlas (fig. 1, upper panel, see link). Unlike PGDS, a robust marker of the meninges, PGR and PGRMC1 were not expressed in mouse meninges, except in dispersed places. As the images of the Allen atlas do not engage the leptumenincs, we have carried out an additional immunohistochemical analysis of the PGR and PGRMC1 progesterone receptors in mouse meninges. We show that PGRMC1 is expressed in the arachnoid cells from E18 both at the base of the skull and convexity. On the other hand, we were unable to highlight PGR nuclear coloring in the arachnoid and the development dura of development and adults (fig. 1, lower panel). Bulk RNA sequencing data from the neonatal duration confirm the expression of PGRMC1 and PGRMC2 in mouse meninges, but no PGR [19], as in the unicellular analyzes of the normal human dura [20]. Due to the similarity of the expression profiles of progesterone receptors in mice and humans, at least at the transcriptomic level, we considered that the mouse could be a reliable model of hormonal impregnation.
PIK3CA mutation in postnatal meningeled cells is sufficient to promote the formation of meningiomas in mice
Pour étudier le rôle de la mutation de Pik3ca dans la tumorigenèse méningée, nous avions précédemment généré une cohorte de souris PGDSCre;Pik3ca et observé que l’activation prénatale de Pik3ca dans les cellules PGDS-positives n’était pas suffisante pour favoriser la tumorigenèse des méningiomes chez la souris. Nous avons donc cherché à analyser l’effet de l’activation postnatale de Pik3ca et avons généré une première cohorte de 20 souris Pik3caflox/flox auxquelles nous avons injecté de l’adCre (volume moyen : 3 μL) entre le jour 2 et le jour 5 postnatal (tableau 1 et figure 2, voir lien). En raison de la diffusion intravasculaire et sous-cutanée de l’adCre, nous avons observé 95 % d’hypertrophie précoce de la tête associée à des malformations vasculaires sous-cutanées, conduisant à une mortalité précoce (survie moyenne : 1,6 mois) (Fig. 1 supplémentaire). Lors de l’analyse histologique, nous avons néanmoins observé 30% de méningiomes, dont une souris avec deux méningiomes distincts de sous-types histologiques différents (Fig. 3A) et une tumeur de grade II avec invasion cérébrale et plusieurs mitoses chez une souris âgée de 9 mois (Fig. 3C, D). Il est intéressant de noter que nous avons également observé un cas de cavernome intraparenchymateux (Fig. 3B).
Nous avons également décidé d’analyser l’effet de l’activation de Pik3ca dans les méninges de souris adultes. Une cohorte de 22 souris Pik3caflox/flox a donc été injectée avec de l’adCre (volume moyen : 6 μL) à 6 semaines, soit au niveau de la convexité (15 souris), soit au niveau de la base du crâne (7 souris). Nous avons observé 50 % de méningiomes, dont une souris hébergeant un méningiome fibroblastique de la convexité et un méningiome transitionnel de la base du crâne (Fig. 3E, F). Alors que les méningiomes étaient principalement méningothéliaux dans le modèle postnatal (5/6, 83%), ils étaient principalement fibroblastiques dans le modèle adulte (7/11, 63%).
Overall, these results demonstrate that the postnatal expression of a mutant form of Pik3ca in the meninges is sufficient to promote the formation of meningiomas of different histological grades and subtypes, unlike the prenatal expression.
Cyproterone acetate does not promote the formation of meningiomas in mice, whether alone or in combination with mutations of Pik3CA or NF2.
Afin d’étudier le rôle de la prise de progestatifs sur la tumorigenèse des méningiomes, nous avons traité une cohorte de 29 souris de type sauvage avec de l’acétate de cyprotérone (ACP) pendant 9 mois. Après un suivi moyen de 11 mois, nous n’avons trouvé aucun méningiome à l’analyse histologique mais avons observé une hypertrophie de l’utérus (Fig. 4A) chez toutes les souris, démontrant ainsi l’imprégnation par l’ACP, comme décrit précédemment dans les modèles murins de cancer du sein. De manière intéressante, nous avons également découvert des tumeurs mammaires chez 90% des souris, définies comme des carcinomes muco-épidermoïdes du sein (Fig. 4B, C) et un kyste épidermoïde intramédullaire rachidien (Fig. 4D). Afin de déterminer si la prise de progestatifs et l’activation de Pik3ca pouvaient se synergiser pour favoriser la formation de méningiomes chez la souris, nous avons traité une cohorte de 22 souris PGDSCre ; Pik3caH1047R avec de l’ACP pendant 8 mois. Comme pour le premier groupe imprégné d’ACP, les souris ont été sacrifiées après un suivi moyen de 8,3 mois en raison de tumeurs mammaires. Le diagnostic histologique n’a révélé aucun méningiome. La fréquence des méningiomes étant faible chez les souris PGDSCre ; Pik3caH1047R, nous avons cherché à déterminer si la prise de l’ACP pouvait entrer en synergie avec l’activation postnatale des mutations Pik3ca. Afin d’éviter les effets de la diffusion intravasculaire et sous-cutanée de l’adCre, nous avons abaissé le volume injecté à 1 μL et généré deux cohortes de souris adCre ; Pik3caH1047R avec (13 souris) et sans (14 souris) imprégnation de l’ACP. Le taux de malformations vasculaires sous-cutanées a été abaissé à 62% dans le groupe témoin et à 23% dans le groupe traité par ACP. La survie des souris a néanmoins été réduite (Fig. 2B), et 10 souris sur 13 n’ont reçu que 3 mois d’imprégnation à l’ACP, contre 9 mois dans les cohortes précédentes. Alors que la fréquence des méningiomes dans le groupe témoin était similaire à celle de notre cohorte précédente (29 % contre 30 %), elle était beaucoup plus faible (8 %) dans le groupe traité à l’ACP.
Enfin, nous avons postulé que la prise de progestatifs pouvait contribuer à la croissance de tumeurs bénignes préexistantes. Nous avons donc décidé de traiter une cohorte de 17 souris PGDSCrehet ; Nf2del2/flox avec de l’acétate de cyprotérone par rapport à une cohorte témoin de 19 souris PGDSCrehet ; Nf2del2/flox. L’analyse histologique après un suivi moyen de 9,5 mois a révélé 88 % de méningiomes fibroblastiques de la base du crâne dans le groupe traité par ACP et 89 % de méningiomes fibroblastiques de la base du crâne dans le groupe témoin. La taille moyenne de la tumeur était de 0,2294 mm2 (médiane : 0,118 mm2 ; intervalle : 0,033-0,718) dans le groupe traité par ACP et de 0,305 dans le groupe témoin (médiane : 0,256 mm2 ; intervalle : 0,067-0,823). Nous n’avons pas trouvé de différence statistiquement significative dans la taille des tumeurs entre les deux groupes. Collectivement, ces résultats indiquent que l’acétate de cyprotérone n’a pas favorisé la formation et/ou la progression des méningiomes chez les souris, que ce soit sur un fond génétique lié à Pik3ca ou à Nf2.
PIK3CA mutations, but not cyproterone acetate increases the proliferation of in vitro cells in vitro
Pour analyser l’effet de l’activation de Pik3ca dans les méninges en fonction de leur nature, nous avons établi des cultures primaires d’arachnoïde et de dure-mère à partir des méninges de la base du crâne de souris Pik3caH1047R. L’infection par AdCre des cellules primaires in vitro a été évaluée par la détection de la fluorescence de la GFP (Fig. 5C). Aucune fluorescence n’a été exprimée dans les cellules témoins infectées par adLacZ (données non présentées). Les tests de prolifération ont montré que l’expression de Pik3caH1047R induisait un avantage prolifératif à la fois dans les cellules arachnoïdiennes et durales au jour 9 (p < 0,05, test t) (Fig. 5A, B). La prolifération accrue a été associée à l’activation de la voie Pi3k-Akt-mTor par une phosphorylation accrue d’Akt et de S6RP (Fig. 5D) démontrée à la fois dans l’arachnoïde et la dure-mère (Tableau supplémentaire 1). L’acétate de cyprotérone n’a pas permis d’augmenter la prolifération cellulaire des cellules durales, que ce soit seul ou en combinaison avec l’expression de Pik3caH1047R (Fig. 5E, G). Dans les cellules arachnoïdiennes, cependant, l’acétate de cyprotérone a augmenté la prolifération cellulaire, seul et en combinaison avec l’ACP, sans atteindre une signification statistique (Fig. 5F, H).
Analysis of the exome of tumors and meninges linked to hormone and pik3ca in mice
In order to determine whether the impregnation of progestins is enough to promote mutagenesis in mouse tissues, we have decided to carry out an analysis of the exoment on mouse brain treated with ACP compared to control of control and in breast tumors linked to the ACP, either on a wild -type background, or on a background of mutant PIK3CA. Five tumors and two meninges were analyzed. We did not find an oncogenic mutation in the mouse brain. In the breast tumor developed on a wild -type background, no oncogenic mutation has been observed. It is interesting to note that in the breast tumors developed in combination with PIK3CA mutations, we have found additional mutations already described in human breast tumors, including mutations of MAP2K4 and CTNNB1 described in the Cosmic database (Fig. 6 and additional table 2, see link).
